评述：一种用于大尺寸组织透明化样品的新型浸液显微物镜

研究背景

      自16世纪显微镜被发明以来，经过广大科研工作者的不懈努力，性能越来越强，种类也越来越多。随着21世纪以来科技的快速发展，类似于组织透明化的新技术不断涌现，对显微成像技术提出了新的挑战。

      近十年来，在生物医学领域，将小鼠脑部(≈1cm³)整体透明化加以研究已经成为了常态，甚至已经实现了人类器官的透明化。对这些大尺寸透明化样本的观测要求显微物镜的数值孔径(NA)得高、工作距离(WD)要长、视场(FOV)也必须够大。此外，常见的组织透明化分为有机溶剂透明技术、亲水性试剂透明技术、水凝胶包埋组织透明技术三类。它们所用透化剂多种多样，即使同一技术使用的化学试剂也可能不同，折射率覆盖范围很广(1.33~1.56)。现有的商业物镜虽然针对性的研制出了校正环，但在普适性上仍有不足之处。

论文导读

      21世纪以来，随着社会的快速发展，人们的生活条件越来越好，对健康问题的重视程度也越来越高。因此，生物医学研究领域受到了国家的重点关注，有多个研究方向列入了《国家自然科学基金“十四五”发展规划》中的优先发展领域名单，如脑科学和类脑模型等。

      在生物医学领域，对大脑等生物器官、组织甚至是细胞的结构和功能的研究离不开显微成像技术。但是，绝大多数的生物组织都是不透明的。显微镜只能让人看见表面，看不见内部。在很长的一段时间内，人们不得不通过切片、固定、染色等步骤来解决这一问题。目前，此类组织学方法仍然是癌症诊断的“金标准”。问题在于，切片是一个劳动密集型工作，切片行为可能对微观结构造成一定的破坏，而且切出来的样本仅能提供二维信息。虽然多个切片联合在一起可以实现一定程度上的三维成像，但是在深度方向上的空间分辨率通常不是很高。那么有没有办法能够不做切片，直接观测到生物组织的整体结构呢？

      为了解决这一问题，学者们发明了组织透明化技术(tissue clearing 或 tissue optical clearing)。组织透明化技术利用化学试剂浸泡样品，去除或溶解组织中的脂质，使得生物组织的光散射和光吸收最小化，从而变得透明，以真正实现样品的三维显微成像。透明化后可以通过组织细胞特异性标记以及显微镜观察与统计，对目标蛋白、核酸、亚细胞结构等进行明确的定性、定位和定量分析。

      常见的生物显微镜多用来观察组织切片，放大倍率越大，物镜和样本之间的成像距离越近。组织透明化的优势就在于可以对生物组织进行整体观测，而大脑等生物组织的尺寸都比较大，很难塞到常规生物显微镜下去观察。因此，组织透明化相关的研究需要用到专用的显微镜，如光片显微镜(Light-sheet microscopy)。

      美国哈佛大学分子与细胞生物学系的Fabian F. Voigt等人以扇贝的眼睛为蓝本，提出了一种由施密特望远镜改造而来的新型浸液显微物镜，为大尺寸组织透明化样品的研究提供了强有力的科研工具。相关成果以Reflective multi-immersion microscope objectives inspired by the Schmidt telescope为题发表在Nature Biotechnology上。

技术突破

      该文的通信作者，分子生物学家Fabian F. Voigt在阅读一本关于动物视觉的书时，发现扇贝的眼睛结构与众不同，如图1a所示。与常见动物只有两只眼睛不同，扇贝在外壳边缘的外套膜内长有200多只蓝色的小眼睛。成像的原理也有其独特之处：光线经过瞳孔，由晶状体稍作会聚，穿过视网膜后由一个类似凹面镜的银膜层进一步聚焦，再次反射回视网膜形成清晰地像。以此看来扇贝的“眼睛们”相当于一个施密特望远镜阵列。这一特点使得扇贝具有250度的视角和绝佳的水下视力，甚至能看清藻类孢子、有机碎屑和几乎透明的浮游生物。

      回到显微物镜这边来，物镜是通过折射来聚焦成像的，其数值孔径与周边环境的折射率成正比。因此，通过浸入高折射率液体的方式实现大数值孔径成像属于常规操作。但是，对于组织透明化应用来说，由于浸泡样本的透化剂不同，折射率差异大，因此显微物镜的数值孔径也随之变化，进而影响像差校正，引发图像劣化。设计更加复杂的物镜结构，引入校正环或者调整物镜内部透镜组位置可以部分解决这一问题，但又引出了成本和价格问题。

      借鉴扇贝眼睛的特点，如果使用凹面镜来聚焦成像，反射光的路径、焦点和单色像差不受环境折射率的影响，就可以避免透化剂对成像质量的影响了，如图1c所示。此外，在数值孔径相同的前提下，反射成像的工作距离更长，因此非常适合用来做透明化组织的成像。

      该文作者通过以下几步将施密特天文望远镜转变为浸液显微物镜：1、将天文望远镜的米级孔径缩小到适合显微镜的厘米级孔径；2、用荧光标记的样品替换望远镜焦点处的成像器件；3、不再聚焦来自恒星的光，改为聚焦和扫描激励光；4、用液体填充凹面镜和校正镜片之间的空间；5、为了解决校正镜片和填充液体的交界面处引入的像差问题，作者将校正镜片的迎光面设计成消球差的形状，背光面的形状(作者称其为‘微折射’表面)则保证激励光可以垂直出射。这样的一个校正镜片可以适用于各种不同折射率的填充液体，解决普适性问题。之所以叫做‘微折射’是因为对透明化样品的显微成像常会用到激光扫描系统，物镜处的扫描角度一般仅为几度，引发的微小折射仍可保证该物镜有毫米级的视场。作者将这种新型显微物镜称为‘施密特物镜’。

      在实际操作中，作者用理论分析和Zemax光学仿真对施密特物镜的结构进行了优化设计。校正镜片和凹面镜都是石英玻璃材质。凹面镜镀铝膜，直径3cm。工作距离，即从凹面镜外缘到焦点的距离，为11mm；入瞳直径22mm；用水做填充时，NA=0.92，FOV=1.4mm；填充液体为ECI，DBE或BABB这些折射率为1.56的透化剂时，NA=1.08，FOV=1.1mm。

      对透明化样本成像的实验装置如图2a所示，施密特物镜如图2c所示。采用波长范围为750-1000nm的可调谐掺钛蓝宝石飞秒激光器作为光源。激励光穿过电光开关后由一个伽利略望远镜扩束；两个扫描振镜将其导入一个4F光学系统进行准直；激励光束穿过校正镜片后被凹面镜反射聚焦到样本上；穿过样本的激励光和激发出的荧光出射后，荧光被NIE/VIS二向色滤光片分离出来聚焦到光电倍增管上。

      该文首先利用尺寸为200nm的荧光微球来测试施密特物镜的性能。激光器的工作波长为800nm。浸液腔空置时轴上点扩散函数(PSF)为0.56±0.01μm(x轴，mean±s.e.m.)、0.49±0.07μm(y)、1.93±0.1μm(z)；使用水作为填充液体时，PSF为0.42±0.04μm(x)、0.43±0.03μm(y)、1.65±0.1μm(z)；使用折射率为1.45的浸镜油时，PSF为0.36±0.01μm(x)、0.33±0.01μm(y)、1.33±0.09μm(z)；使用折射率为1.51的浸镜油时，PSF为0.36±0.02μm(x)、0.32±0.02μm(y)、1.36±0.01μm(z)；在整个折射率范围内，PSF接近衍射极限。在视场方面，因为光束扫描时的‘微折射’引入的离轴像差和衍射限制，振镜扫描角度为±1.75°，在空气、水和两种浸镜油中的FOV如图2e所示。数值孔径如图2d所示。

      作者使用施密特物镜对多种透明样品进行了显微成像以展示其性能，包括：花粉团表面特征(图3a，浸液腔空置)、5日龄斑马鱼幼虫的神经活动(图3b，水填充)、透明化的3日龄蝌蚪的视网膜(图3c，BABB填充)、小鼠脑部4mm厚切片的神经树突(图3d，DBE填充)、人脑新皮质的神经元胞体(图3d，5×7×4mm³，ECI填充)。

观点评述

      该文以扇贝的眼睛和施密特天文望远镜为参考，发明了一种新的浸液显微物镜——“施密特物镜”。文中对所有样本的实验操作和化学处理有必要的论述。线上资料中有相关研究和实验的视频。在论文的支撑材料中还有理论分析和光学仿真的内容。

      虽然施密特物镜只有三个光学表面，但具有工作距离长、数值孔径高、视场大的特点，非常适合用来做大尺寸透明化样本的研究。该物镜结构简单成本不高，却能在理论上适用于各种具有不同折射率的浸润液体。因此，该成果对生物医学领域有着重要的实用价值。

      此外，作者由一个偶然的发现激发出灵感，再经过科学的思考确定研究方案，接着利用理论分析和数值模拟优化结构，最后利用实验加以验证。该文有新的基于仿生学的光学设计思想，做出了具体的器件并加以应用，是一个有代表性的科研案例，具有重要的学术价值。

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