《红外与激光工程》第2期封面：数字全息显微中自动调焦技术及其应用_技术资讯_资讯信息

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撰稿 | 西安电子科技大学王宇郜鹏

数字全息显微中自动调焦技术及其应用（封面）(特邀）

doi: 10.3788/IRLA20200530

----2021年第50卷第2期

王宇，温凯，张美玲，马英，刘旻，郑娟娟，郜鹏

西安电子科技大学物理与光电工程学院

研究背景

万物积微而著，微观世界的奥秘往往蕴藏了宏观问题的本质，这是人类不断探索微观世界的不竭动力。光学显微镜，自16世纪诞生以来一直作为人们认识微观世界的重要手段，在生物医学、材料化学、工业检测等领域发挥着不可替代的作用。然而，传统的光学显微镜利用样品对光波的吸收/散射来形成衬度，对于透明样品则无能为力。此外，传统的光学显微镜一般通过手动或电动调焦来获得物体清晰的图像（如图1所示），无法对运动物体或动态过程进行实时观测。

图1 显微镜机械调焦示意图[1]

随着科技的不断进步，光学显微技术迎来蓬勃的发展，其中数字全息显微技术(Digital Holographic Microscopy, DHM)将数字全息和显微技术相结合，通过记录被样品反射或透射的物光波与参考光干涉形成的全息图，不仅可以实现对透明样品的高衬度成像，而且可以获得样品厚度、折射率分布等定量信息。此外，通过计算机模拟物光波的衍射传播还可以实现对被测样品的数字调焦[2]。与传统光学显微镜机械调焦方式相比，数字调焦具有速度快、精度高等优点，有助于实现对运动物体或动态过程的跟踪观测和实时干预。原理上，DHM的数字调焦可以概括为两步：1.数字获得离焦距离，即全息图到物体像面的距离；2.利用光波的传输理论将探测器平面的光场传播到样品的像面。如何选择合适的自动调焦评价算法来精确获得离焦距离，是DHM实现自动调焦的关键，也一直是数字全息显微技术中的研究热点。

图2 数字全息显微以及自动调焦示意图

主要内容

作者首先着重介绍了DHM中自动调焦技术中不同离焦量获取方法：基于锐度度量、能量集中度、振幅模量分析、稀疏度测量以及不同照明调制的离焦量获取方法(自动调焦评价函数)。之后概略介绍了自动调焦技术在单细胞成像、识别、追踪、生物组织三维成像，以及环境检测中粒子追踪等方面的应用。最后，作者分析总结了自动调焦技术的优缺点，并简要展望了数字全息显微中自动调焦技术的未来发展趋势。

基于全息图离焦距离的数字获取方法

自动调焦技术的评价函数通过对一系列不同离焦距离下获得的再现图像进行评估，从而得到最佳离焦距离，最后利用该离焦距离再现出最优重建结果。下面将简要介绍几种离焦量的获取方法。

(1)基于锐度度量的离焦量获取方法：对于纯振幅样品，其评价函数在像面处出现极大值；对于纯相位型样品，其评价函数在像面处出现极小值。常用的锐度度量函数有以下几类：基于梯度函数的锐度度量、基于频谱分析的锐度度量、基于图像灰度直方图的锐度度量、基于不同统计关系的锐度度量。

(2)基于能量集中度的离焦量获取方法：利用稀疏样品在像面时其能量(强度)分布最为集中(目标物体所占区域面积最小)这一特性来获得最佳聚焦距离。该方法不足之处在于会提高计算成本，降低运算速度，且不适用于内部结构过于复杂的样品。

(3)基于振幅模量分析及其改进的离焦量获取方法：在最佳聚焦平面上，纯振幅物体的再现像振幅模量积分达到最小值，而纯相位物体的振幅模量积分达到最大值。其改进方法主要有：1)基于频域分析的振幅模量评价函数(频域L1范数)，通过在频域计算评价函数，有效减小计算量并节省计算时间；2)通过将高通滤波器与物体的复振幅进行卷积引入到振幅模量分析中，对于振幅/相位样品，其评价函数产生具有相同变化趋势的评价曲线；3)由单色DHM被扩展到彩色DHM来拓展其应用范围。

(4)基于稀疏度测量的离焦量获取方法：将菲涅尔衍射积分可用稀疏信号来表示，通过计算在不同离焦距离处再现像的稀疏度测量系数获得最佳离焦距离，其评价函数曲线只有一个全局极值点，可以准确无误地获得聚焦距离。

(5)基于不同照明调制方式的离焦量获取方法：通过利用样品在多元照明下的再现像的差异性作为判据来寻找像面，可以消除传统自动调焦方法对样品类型的依赖性，在对物体实现自动调焦的同时还具有降低散斑噪声和离焦背景以及提高空间分辨率的优势。其不同照明调制方式有：离轴照明、双波长照明、4π照明以及结构光照明等。

这些自动调焦评价函数是用来评价图像清晰度的依据标准，其曲线应满足单峰性和收敛性。利用这些自动调焦算法评价函数确定最佳聚焦距离，最后通过计算机模拟物光波的衍射传播以实现对被测样品的数字调焦。DHM自动调焦技术的出现使DHM能够通过单次曝光实现对待测样品的准确定位聚焦，为观测透明/半透明样品动态过程提供便利。

数字全息显微中自动调焦技术的应用

DHM自动调焦技术因其速度快、精度高等优点，展现了巨大的应用潜力，并且随着自动调焦技术的不断创新发展，其应用范围和程度也在不断加深，为多个领域的不同应用提供实时、高衬度、高精度的二维和三维数据，对其进行更加全面地阐述与分析。数字全息显微中自动调焦技术的应用主要可归为以下几类：

(1)单细胞成像、识别、追踪：1)细胞成像：对全息图进行实时再现以获得清晰图像(振幅/相位信息)，高衬度地观测透明细胞，定量获得细胞的三维形貌或折射率分布等信息。2)细胞识别：根据获得的细胞厚度信息以及其它不同特征，用于识别细胞种类或健康状态。3)细胞追踪：确定任意细胞的三维空间位置坐标，进而获得细胞在空间中的三维运动轨迹。

(2)生物组织三维成像：自然界的微型生物大都具有十分精细的内部结构和组织，这些内部结构和组织尺寸一般在几十到几百微米之间。对微生物三维精细结构及内部组织进行成像对于了解微型生物的复杂生命动态过程具有重要意义。

(3)环境监测中粒子追踪：对空气和流体中立方毫米量级内的多个粒子进行高衬度成像与实时追踪，实现对粒子形貌、粒径、空间浓度等特性的精确测量，同时获取粒子的3D位置信息，3D可视化粒子的动态运动。

图3 DHM对生物组织（胆幼虫）的自动调焦成像[3]

展望

数字全息显微(DHM)技术无需荧光标记、能够高衬度地观测透明样品，还能定量测量样品的三维形貌和折射率分布，在生物医学、材料化学、工业检测等领域具有重要应用价值。DHM自动调焦技术能够对运动样品或动态过程进行快速、精确调焦，尤其在生物医学领域日益发挥着不可替代的作用。目前，DHM自动调焦技术业已成为数字全息显微技术中的一个研究热点，今后还将会朝着计算速度快、重构精度高、不局限于样品特性等目标快速发展。尤其是随着计算机技术和人工智能的不断推广，自动调焦的速度和准确性将会达到进一步的提升，有望在生物医学、材料化学、工业检测等领域得到更加广泛的应用。

参考文献

[1].https://image.baidu.com/search/detail?ct=503316480.

[2].Vicente Micó, Juanjuan Zheng, Javier Garcia, Zeev Zalevsky, Peng Gao. Resolution enhancement in quantitative phase microscopy[J]. Advances in Optics and Photonics. 2019, 11(1): 135-214.

[3].Wolfgang Osten, Ahmad Faridian, Peng Gao, Klaus Körner, Dinesh N. Naik, Giancarlo Pedrini, Alok Kumar Singh, Mitsuo Takeda, Marc Wilke. Recent advances in digital holography[J]. Applied Optics. 2014, 53(27): G44-G63.

作者简介

王宇，男，硕士生，目前从事相位显微成像方面的研究。曾获2020年陕西省科技工作者创新创业大赛“三等奖”(排名第5)、西安电子科技大学第十二届“挑战杯”大学生创业计划竞赛“银奖”，西安电子科技大学第六届“校长杯”创新创业大赛“铜奖”。

郜鹏，男，西安电子科技大学教授、博士生导师。主要研究方向为：超分辨光学显微、相位显微以及荧光相关光谱技术。迄今在Nature Photonics、Advance of Optics and photonics等学术期刊发表研究论文50余篇、授权发明专利6项。研究工作曾被选为期刊封面、美国光学学会-研究热点，并被海外媒体ScienceDaily，Physics News等所报道。2011年入选“中科院百篇优秀博士论文”，2012年德国“洪堡学者”，2014年欧盟“玛丽居里学者”(IEF)，2020年陕西省青年科技奖。目前是中国激光杂志社青年编委、红外与激光工程青年编委、全息与光信息处理专委会委员、生物光子学委员会高级会员、波兰自然基金委评审专家。

引用格式

Wang Yu, Wen Kai, Zhang Meiling, Ma Ying, Liu Min, Zheng Juanjuan, Gao Peng. Autofocusing techniques in digital holographic microscopy and their applications （Cover paper） (Invited)[J]. Infrared and Laser Engineering, 2021, 50(2): 20200530. doi: 10.3788/IRLA20200530

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