Optica | 同时多层成像的光片显微镜

研究背景

      动物的行为产生通常是大脑中大量神经元协同作用的结果。这些神经元往往分布在不同深度和不同脑区。快速地获取这些不同位置神经元的活动，是揭示其所处神经功能环路上、下游位置的关键。因此，提升三维显微成像速度是解决这一问题的关键。

      并行成像是提升三维显微成像速度的核心。例如，将空间光调制器放置在物镜后瞳共轭面，研究者可以同时产生多个焦点或者贝塞尔光束来同时照亮样本不同深度， 即：在轴向（z-轴）实现了一维并行成像，对应的三维成像速度被提升了一个数量级。然而，为了获取完整的三维信息，此方法仍需要在另外两个维度（x-轴和y-轴）扫描近百万个点，这严重限制了其最大三维成像速度。以LSFM为代表的二维并行照明和探测的成像方式，进一步将三维成像速度提升了一个数量级。然而，受限于LSFM固有的逐层片状照明和探测的设计，其无法同时捕获位于不同深度神经元的活动。因此，三维并行成像成为了快速捕获不同深度信息的重要手段。例如，在探测光路中放置多焦点光栅，利用衍射原理，研究者可以将样本不同深度的荧光信号同时投影在不同相机或者同一相机的不同子区域。然而，多焦点光栅本身加工完成后，无法灵活更换，则该种方法无法使研究者根据感兴趣的深度有选择性地调整探测平面。通过在探测光路中引入微透镜阵列来编码三维空间和角度信息，光场显微镜作为一种可以同时捕获整个三维空间所有信息的技术逐渐变得流行起来。然而，传统的光场显微镜存在两个潜在的问题：第一，传统光场显微镜往往采用非选择性地落射式照明，无选择性地从上至下照亮样本所有位置，从而引入非感兴趣位置信号的干扰。因此，很难实现单细胞分辨率的三维成像效果；第二，若微透镜阵列不放置在物镜后瞳共轭面上，则点扩散函数分布会沿着x，y和z三个方向改变，从而使测量成像系统的真实PSF非常困难，因而研究者往往只能利用实验仿真的PSF进行后期三维重建，无法实现好的三维重建效果。

论文导读

      单细胞分辨率下捕获不同深度神经元的响应顺序，是判断活体动物潜在神经功能环路的重要参考。光片荧光显微镜（Light-sheet fluorescence microscopy，LSFM）自发明以来已被广泛应用到斑马鱼全脑神经元功能成像领域。然而，受限于单平面照明和单平面探测，位于不同深度的神经元活动不可能被同时记录到。为了解决这一挑战，武汉光电国家研究中心付玲教授团队与中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心的杜久林研究员、穆宇研究员的合作，在Optica发表封面论文“Simultaneous multi-plane imaging light-sheet fluorescence microscopy for simultaneously acquiring neuronal activity at varying depths”。文中，作者将同时多层照明或选择区域照明的方式和基于球差辅助的点扩散函数（Point spread function，PSF）结合起来，开发了一种同时多层成像的光片荧光显微镜（SImultaneous Multi-PLanE imaging Light-Sheet Fluorescence Microscopy，SIMPLE-LSFM）。利用SIMPLE-LSFM，成功地在毫米量级视场范围、细胞分辨水平和>100Hz的成像速度下，同时记录了幼龄斑马鱼6个不同深度神经元活动并捕获了不同深度神经元的先后响应顺序。

技术突破

      为了以单细胞分辨率同时获取样本内不同深度神经元的活动信号，本文开发了一种并行的SIMPLE-LSFM。如图1（a-a1）所示，在SIMPLE-LSFM中，可编程的强度调制器件——数字微镜阵列（Digital micro-mirror device，DMD）被引入照明光路，从侧面同时照亮样本的不同深度。相对于落射式的照明方式，SIMPLE-LSFM避免了额外背景噪声的干扰，提高了后期三维重建效果。在探测端，通过在探测物镜和样本之间引入具有一定厚度和折射率的玻璃，人为地引入球差。一方面拉长了PSF的轴向范围，另一方面不同深度的PSF具有不同大小的旁瓣，从而实现了对来自样本不同深度荧光信号的编码。额外球差对PSF的影响具有平移不变性，因此，借助实验中测量得到的三维PSF、来着样本不同深度荧光信号的二维投影和三维反卷积算法，本文可以成功地从单张二维图像中恢复来自不同深度的原始信号。图1（b-g）为同时成像5层直径为6微米的荧光小球样本的实验流程示意图。

      为了验证SIMPLE-LSFM在生物样本中的成像效果，本文首先在表达单胺能神经元的幼龄斑马鱼(Vmat-GCaMP6s，8 dpf)中对位于6层不同深度的神经元进行同时成像，并观察其在应对紫色闪光刺激之后的神经元活动情况。图2（a）为逐层照亮和逐层反卷积得到的斑马鱼6个不同深度神经元的结构，作为先验信息。图2（b）最左侧为同时成像6层不同深度神经元的原始二维投影；右侧为应用三维反卷积之后恢复出的6层神经元的结构。如图2（c）所示，通过放大先验信息和三维重建后的神经元结构，本文可以看到三维重建的大部分神经元具有单细胞分辨水平。为了进一步验证SIMPLE-LSFM对不同深度神经元信号的捕获能力，对该鱼进行了紫色闪光刺激，并以~150Hz的速度观察到了来自不同深度的神经元活动的先后顺序。

      除了同时多层成像模式外，由于DMD的灵活照明模式，SIMPLE-LSFM也能提供感兴趣区域成像模式。如图3（a）所示，在神经元表达很密集的斑马鱼系中，使用同时多层成像模式往往无法获得很好的三维重建效果。因此，在该种成像模式下，可以选择性地照亮斑马鱼不同深度且轴向无重叠的神经元。此种情形下，在相机表面的二维投影可以被简单的分割为只包含同一种PSF的子区域。对每一个子区域进行二维反卷积，则可以获得最佳的重建效果。例如，此处同时记录了斑马鱼大脑分布在五个不同脑区（包括 P5 的缰核、P4 的光学顶盖和被盖、P3 和 P2 的后脑以及P1的脊髓）的 1182 个神经元。成像范围跨越 665 μm × 1331 μm× 131 μm（从不同 z 深度投影的样本的二维平面），以研究斑马鱼遇到闪光刺激时的神经元反应。

      本实验中，使用泛神经元表达的斑马鱼幼鱼 (8dpf, Tg(elavl3:H2B-GCaMP6f))。该鱼系的钙指示剂在细胞核中表达，使得神经元细胞体呈球形。利用已经测量得到的PSF对每个深度进行 2D 后反卷积后，通过后期的神经元分割算法检测到 1182 个神经元（图 3（b-b1））。图 3（b-b1）中的蓝点代表被检测到的神经元中心。总的来说，大约90% 的神经元被正确检测到。为了分析几个脑区神经元的反应先后时间，通过计算 △F/F 并根据闪光刺激后的反应时间对它们进行排序来绘制钙活动的热图。如图 3（c-e）所示，左视顶盖中的近 30 个神经元、后脑中的 7 个神经元和缰核中的 6 个神经元在闪光后立即被激活。该实验成功捕获了位于不同深度神经元的放电序列，这意味着 SIMPLE-LSFM 具有记录不同深度的神经元响应顺序的能力。

观点评述

      本文提出了一种同时多层成像的光片荧光显微镜，该技术可以同时激发、探测并重建来自样本不同深度的神经元信号。由于照明端的灵活性，SIMPLE-LSFM不仅仅可以实现类似LSFM的顺序采集模式，还可以实现两种同时多深度成像的并行采集模式：同时多层成像和选择区域成像模式，极大地拓展了SIMPLE-LSFM的应用场景。在具有不同表达斑马鱼样本中进行了实验验证，证明了SIMPLE-LSFM在幼龄斑马鱼中可以实现毫米量级的成像视场、细胞分辨能力和>100Hz的体成像速度，揭示了其在幼龄斑马鱼全脑神经功能环路研究中的巨大潜力。

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