Nature Photonics | 针形光声显微技术实现脑血管的大景深体积成像

研究背景

      在光学显微成像领域，为了将分辨率提高到衍射极限，通常要求光学系统精准聚焦，因而造成了景深小的普遍问题。当目标表面不平整或者需要对目标进行体积成像时，必须使用空间扫描的方法才能得到完整的高分辨率图像。一方面增加了系统的复杂性、体积和成本，另一方面也更加费时费力。对于医疗领域的术中组织学或者脑血流动力学研究这一类对时效性有较高要求的应用来说，现有的光声显微成像技术就不太适用了，需要研发具有高分辨率大自由度且能对不规则表面直接成像的技术。

      为了解决景深问题，专家学者们做了多方面的努力，主要包括：动态远程聚焦、解耦照明检测系统(如片光显微镜)、基于空间或频域复用的多平面显微、使用无衍射光束(如贝塞尔光束)和深度学习等。前两者会增加系统的复杂度。空间域多平面显微需要额外校准。频域多平面显微的图像重建算法较为复杂。无衍射光束旁瓣严重，效率低，成像质量不佳。深度学习受样本库涵盖面的影响，普适性相对较差。

      在光声显微成像领域，也存在空间分辨率和景深的问题。以最具代表性的光学分辨率光声显微成像(OR-PAM)技术为例，通常而言，空间分辨率越高，景深越小，轴向成像范围越窄。

论文导读

      光声显微成像技术是近年来发展起来的一种新型生物医学成像方法。这一技术利用短脉冲激光照射生物组织，组织吸收光能量后升温产生热膨胀进而发出压力波，即声音信号。所产生的声音信号频率与入射光波频率一致。通过对声音信号的解析即可获取生物组织的特性参数分布，实现显微成像效果。得益于生物组织中的很多成分都对光有吸收作用，且不同组分所吸收光的波长有一定区别，光声显微成像技术在DNA/RNA、细胞色素、血红蛋白、黑色素瘤和脂质等不同研究方向上都有着广泛而重要的应用。

      美国加州理工大学光学成像实验室联合斯坦福大学结构生物学系、宾夕法尼亚大学电气与系统工程系、南加利福尼亚大学生物医学工程与眼科学系等多家科研机构提出了一种使用特制衍射元件将光束调制为针形以激发光声效应的显微镜，将光声成像的景深提高到瑞利长度的28倍，实现了小鼠脑血管的在体大景深体积成像。相关成果以Optical-resolution photoacoustic microscopy with a needle-shaped beam为题发表在Nature Photonics上。

技术突破

      本文所述的针形光声显微成像系统(NB-PAM)如图1e所示。入射光经过特制的衍射元件(DOE)和透镜后，在轴向上多个相邻的位置聚焦(如图1a所示)。当相邻焦点的平均间隔小于瑞利长度时，所有焦点集合成一条针形光束(如图1b所示)。

      衍射元件是用500微米厚的光学玻璃通过光刻制作而成的，其相位分布可以用下式表述：

      式中，（x,y）代表DOE平面的坐标，n是环境折射率，λ是光的波长，f是透镜的焦距，M是针形光束中预定焦点的个数，m是预定焦点的序号，f_m是预定的聚焦位置，πmA是用来调节光束直径的调相器，[-πn(x²+y²)(1/f_m-1/f)/λ-πmA]是将焦点从f移到f_m处的位移分量，Loc_m(x,y)是将m个焦点的相位随机均匀地分配给DOE各个像素的二值矩阵。光束长度（f_m-f₁）可以通过焦点数量的增减来调整。

      本文用到的两个DOE的像素数均为1024×1024，像素尺寸分别为10和15微米(由入射光直径决定)。266nm紫外光由Nd:YLF纳秒激光器作为光源，所用DOE产生的针形光束(64个焦点)尺寸为200×1.2微米(半峰宽FWHM光束长度×最小光束直径)，如图1d所示。从图中可以看出：在传播方向上，针形光束直径的一致性较好，轴向光强分布均匀且几乎没有旁瓣。532nm绿光所用的DOE产生的针形光束(81个焦点)尺寸为1000×2.3微米。使用DOE后，入射光的使用效率可以达到30%，远高于贝塞尔光束的20%。

      本文用1951 USAF 多对比度分辨率板对常规的使用高斯光束的光声显微成像系统(GB-PAM)和使用针形光束的NB-PAM的成像分辨率做了对比，结果如图2所示。从图2a至e中可以看出GB-PAM拍摄时距离焦平面(z=0)越远图像越模糊，景深很小，约为30μm；NB-PAM拍摄的图像则始终清晰，景深大约为200μm，有了明显的改善。从图2f和g可以看出，GB-PAM的半峰宽(FWHM)分辨率为1.1μm(266nm)；NB-PAM的半峰宽(FWHM)分辨率为1.2μm(266nm)，性能相近。

      为了测试NB-PAM系统的体积成像能力。作者首先在一块琼脂中随机加入了一些碳粒作为样品。如图3所示，在266nm紫外光照明下，从景深的角度来看，NB-PAM的成像效果远比GB-PAM要好得多，碳粒直径更加统一。图3c中z轴的间隔30μm是根据超声换能器的带宽和分辨率决定的。其后，作者在另一块琼脂中随机加入了一些碳纤维来测试深度方向的成像能力。这次使用了532nm绿光做实验，结果如图4所示。图中用不同的颜色来代表不同的深度，越偏向蓝色则越深。GB-PAM拍摄的图像(图4c至f)有明显的离焦模糊现象。NB-PAM拍摄的图像则始终保持清晰(图4b至j)，即实现了大景深高分辨率体积成像。

      为了测试NB-PAM对不平整表面的成像能力及其在快速无切片组织学成像领域中的应用潜力。作者用小鼠的新鲜肺叶和脑作为目标，得到的NB-PAM和GB-PAM成像结果如图5所示。图5a和b是肺叶拍摄结果。因肺部表面起伏较大，GB-PAM的景深有限，因此拍摄的图像比较模糊，细节特征不明显，如图5a所示。其中较亮的部分在焦平面附近，也就是在景深范围内，信噪比较高，拍摄效果比其它部分要好得多。与之相对的，NB-PAM拍摄的照片始终具有较高的分辨率和信噪比(图5b)，局部放大后能够看到更多的细节特征。图5c和d是脑组织拍摄结果，同样是NB-PAM拍摄的图像的分辨率更佳，细节更丰富。图中白色线条为脑皮质血管中残留的血液。若要避免血液对脑组织成像的影响，可提前用生理盐水灌注血管洗掉血液来解决。

      作者进一步做了在体实验的研究：对一只小鼠做了透颅脑血管成像后，又剥离其顶部颅骨做了对比实验，结果如图6所示。与图4类似，图中用颜色来代表深度。通过对比可以看到NB-PAM的成像范围更大、分辨率更高、质量更佳，即使在浅层区域拍摄到的血管也比GB-PAM更丰富。

观点评述

      本文所提出的针形光束是通过一个衍射光学元件(DOE)来实现的。加装了DOE以后，不仅光声成像系统的景深得到了扩展，其对入射光的使用效率也有所提高。更加重要的是：DOE只是一块光刻后的光学玻璃镜片，可以很方便的加装到现有的光声显微成像系统中去，改造成本不高。作者还提出了几种改进NB-PAM系统的思路，如进一步优化DOE得到更好的针形光束、使用结构光照明或者快速扫描技术提高成像速度等。

      常规的GB-PAM具有对氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白进行无标记成像的能力，在脑血管成像及功能分析研究领域有着广泛的应用。大脑皮层本身的曲度一直是该领域快速高分辨率成像要面临的一个问题。NB-PAM的出现为解决这一问题提供了一个很好的途径。此外，本文的思路对于其它光学显微技术也有一定的启发作用。

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