封面论文 | 基于虚拟成像的自适应光学显微成像方法及高分辨组织成像

论文导读

      生物组织引入的像差往往会导致光学显微技术的成像性能劣化。利用自适应光学技术对像差进行探测与校正是实现生物组织中高分辨成像的重要途径。近期，武汉光电国家研究中心付玲教授团队在PhotoniX 发表论文“Adaptive optical microscopy via virtual-imaging-assisted wavefront sensing for high-resolution tissue imaging”。文中，作者提出了一种间接波前探测方法，该方法采用虚拟成像的方式结合基于结构相似度的图像偏移测量，可以根据样品自身结构进行像差探测。作者利用该方法在多种离体、活体生物组织中实现了高分辨双光子成像。

研究背景

      自适应光学技术是改善光学显微技术在生物组织中成像性能的有力工具。利用自适应光学技术校正生物组织所引入的像差不仅能够改善成像分辨率，同时还可以提升信号水平。测量像差对应的畸变波前是自适应光学技术中的关键环节，按照测量方式一般可以分为直接波前探测和间接波前探测两类。直接波前探测方法采用专用的波前传感器来对源自样品中引导星的畸变波前进行探测，此类方法通常应用于透明样品。相较之下，间接波前探测方法则根据一系列图像或者信号变化来实现像差测量，这类方法无需波前探测器，因此硬件构成更加简单、同时也可以应用于更加广泛的不透明样品。通过将物镜光瞳分割成一系列子孔径，分区域地测量子波前的梯度并对完整波前进行重构是实现间接波前探测的典型方式，其中对子波前梯度的测量可以通过测量子光束焦斑的偏移来实现。传统方法分别采用全光瞳和子孔径照明获取参考图像和子孔径图像，并根据二者之间的图像偏移推算出子光束焦斑偏移。由于子孔径照明的有效数值孔径显著低于全光瞳照明，因此子光束的焦斑沿轴向发生拉伸。于是当样品结构密集时，额外的样品结构会被记录于子孔径图像中，这将导致难以准确计算出图像偏移。

技术突破

      为了在结构密集的样品中进行子光束焦斑偏移测量，本文提出了基于虚拟成像的测量方法。利用虚拟成像测量子光束焦斑偏移的流程如图1所示。对于一个待测量的子孔径，首先将焦面定位到感兴趣的样品结构（如神经元胞体等）所在的平面（中心成像平面）采集到一张子孔径图像。为了构造出合适的参考图像进行偏移测量，接下来在全光瞳照明下对中心成像平面附近的样品结构进行扫描成像，将采集到的三维图像作为虚拟样品。根据物镜的聚焦模型可以计算出在相同子孔径照明下的理想子光束所对应的点扩散函数（虚拟点扩散函数），于是按照成像模型便可以计算出理想子光束对虚拟样品的成像结果，该成像结果也就是所需的参考图像。由于虚拟点扩散函数与真实点扩散函数在轴向上的尺度相似，因此该参考图像所包含的样品结构也与子孔径图像所包含的样品结构相似。于是可以依据结构相似度计算出两幅图像之间的偏移进而得到子光束聚焦光斑的偏移。

      本文基于双光子显微成像技术实现了所提出的像差测量方法。为了验证该方法在生物组织中的有效性，本文首先在脑片中进行了成像测试，结果如图2（a）所示。由于受到像差影响，荧光信号弱、成像分辨率低，因此神经元胞体和纤维的结构模糊。利用本文提出的方法进行像差测量并校正后，信号强度和分辨率显著提升，这使得丰富的神经纤维结构分布能够被清晰地观察到。为了验证该方法在散射更强的活体生物组织中的有效性，本文接着在活体小鼠肿瘤微环境中进行了成像测试。微环境中的肿瘤细胞、宿主细胞以及微血管分别对应三种不同的荧光标记物，从而可以通过多色成像进行区分。像差校正后，三个颜色通道的信号强度都得到提升，这使得细胞形态更加清晰，同时也让更多信号微弱的微血管可以被观察到。得益于像差校正对分辨率的改善，模糊交叠的微血管也可以被清晰地区分开来。由于所提出的方法可以采用空间光调制器进行实现，因此利用该器件的通用性可以同时实现分辨率增强，本文以差分成像技术为例进行展示。图2（c）是对松树花粉粒的成像结果，各图像按照自身信号峰值进行了归一化处理以显示图像所包含的样品结构差异。成像结果显示两种方法的结合进一步提升了对组织中精细结构的分辨能力。此外，由于活体生物组织中的信号强度可能会随生命活动发生变化，从而影响像差测量并导致像差校正失效，为了验证该情形下的有效性，本文在活体斑马鱼脑组织中进行了成像测试，其中神经元被钙探针标记，且信号强度随自发活动而改变。成像结果如图2（d）所示，采用这些神经元进行像差测量并校正后，原本模糊的胞体轮廓变得清晰，且更多细致的纤维结构可以被清楚地分辨出来。

观点评述

      本文提出了一种利用虚拟成像以及基于结构相似度的图像偏移测量的间接波前探测方法，该方法是一种新的采用光瞳分割实现像差测量的实现方式。利用该方法可以根据样品自身结构进行像差测量，同时对信号变化具有一定的鲁棒性，其有效性在脑片、小鼠肿瘤微环境、斑马鱼脑组织中得到了验证。此外，该方法可以通过共享调制器件的方式与分辨率增强技术相结合，从而进一步提升对生物组织中精细结构的分辨能力。

主要作者

       周舟，武汉光电国家研究中心博士研究生，研究方向为高分辨双光子显微成像技术。

      付玲，华中科技大学武汉光电国家研究中心教授，国家自然科学基金优秀青年科学基金获得者，教育部新世纪优秀人才，美国光学学会会士，国际光学工程学会会士。专注于活体光学显微技术与生物医学应用的交叉研究，在光纤内窥显微成像的原理、器件和仪器等方面开展了系列研究工作，在Neuron等期刊发表论文多篇，核心技术获中国发明专利授权30项。针对卡脖子领域之一的医学影像设备和元器件，将光学显微镜技术转化为临床医疗器械；研制出首个获批医用的国产共聚焦内窥镜，也是全球第二个获批临床应用的探头式共聚焦内窥镜。

• PhotoniX 属同行评议、开放获取（OA）高影响力国际期刊。是中国光学工程学会会刊，由中国光学工程学会、上海理工大学和西湖大学共同主办，由Springer Nature集团出版。上海理工大学顾敏院士和西湖大学仇旻教授担任期刊主编，庄松林院士担任期刊名誉主编。期刊拥有强大的国际编委和编辑团队。PhotoniX 主要报道国内外光学与光子学技术与信息、能源、材料、生命、精密制造、纳米、光电子器件、微纳米电子等学科交叉融合发展带来的颠覆性科研成果和最新的工程应用进展。以展现具有前沿性、多学科交叉和衍生性特点的技术为核心，成为推动国际前沿“使能技术”的平台。

• PhotoniX 现已被SCIE、SCOPUS、DOAJ、ProQuest、CNKI、INSPEC、Dimensions等多个数据库收录，并入选《2021年中国科学院文献情报中心期刊分区》。2022年6月获得首个影响因子：19.818，位列Q1区。

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