Nature Biotech | 陈良怡、李浩宇合作团队发明新型超分辨显微镜！

论文导读

      近日，哈尔滨工业大学李浩宇教授团队与北京大学陈良怡教授团队合作，在光学超分辨显微成像技术领域，发明基于新计算原理的荧光超分辨率显微成像，进一步拓展荧光显微镜的分辨率极限，取得突破性进展。2021年11月16日，该研究成果以"Sparse deconvolution improves the resolution of live-cell super-resolution fluorescence microscopy"为题，以长文形式在线发表在国际权威杂志Nature Biotechnology（2020年IF 54.908）上【1】。

      其中，哈尔滨工业大学博士生赵唯淞、北京大学博士后赵士群、李柳菊为共同第一作者，哈尔滨工业大学仪器科学与工程学院李浩宇教授和北京大学未来技术学院陈良怡教授为论文共同通讯作者。共同作者还包括哈尔滨工业大学谭久彬院士、刘俭教授，北京大学毛珩博士，生科院成像平台单春燕博士和华南师范大学刘彦梅教授。参与合作的实验室包括武汉大学宋保亮教授、北京大学陈兴教授、中科院国家纳米科学中心丁宝全教授和生物物理所纪伟教授等。

      该项工作受到国家自然科学基金委重大研究计划、杰出青年基金，科技部重点研发专项，中国科协青年托举工程，黑龙江省自然科学基金优青，北京市科委、北京市自然基金委和北京大学博雅博士后计划等项目资助，得到北京大学膜生物学重点实验室、麦戈文脑研究所、北大-清华生命科学联合中心、北京智源人工智能研究院的支持，也是多模态跨尺度国家生物医学成像设施建设过程中的重要成果。

研究背景

      现代科技和生物医学的结合发展，极大推动了临床医学领域全面的理念革新与技术进步，光学显微镜作为关键成像仪器，有效支持了精密制造和生命科学领域定性与定量的分析研究。但是光学显微镜分辨率受到了物理衍射极限的限制，2014年诺贝尔化学奖授予了超分辨率荧光显微镜技术，利用控制荧光分子特性的方式，实现了“光学超分辨”成像。这种新兴生物影像工具，使得科学家可以观察分辨生物体乃至细胞内部不同结构成分及其相互作用，能够在生命体和细胞具有活性的状态下，对其功能进行动态记录。

      尽管理论上具有无限的空间分辨率，但活细胞成像中超分辨率显微镜的空间分辨率仍然十分有限。在活细胞中快速移动的亚细胞结构，如管状内质网、脂滴、线粒体和溶酶体，成像时会产生运动伪影，故空间分辨率的任何提升都需要与时间分辨率的增加相匹配。因此，无论使用何种光学超分辨技术，当前活细胞超分辨显微镜的最高分辨率很难达到~60 nm。而为了实现超高的空间分辨率，通常需过度的照明功率（kW~MW/mm²）和长时间曝光（> 2 s），这可能损害整体荧光结构的完整性并降低可实现的有效分辨率。例如具有近60 nm分辨率的非线性结构光显微镜以降低时间分辨率为代价，且需对光漂白敏感的可光活化/光开关荧光蛋白。由于细胞深层内部的分辨率和对比度仍然受到荧光发射和离焦平面散射的影响，因此高对比度超分辨结构光成像限于0.1 μm~1 μm的成像深度。迄今为止，没有一种超分辨方法能够在活细胞中实现约60 nm时空分辨率的毫秒曝光，或者能够进行多色、三维、长期超分辨成像。

技术突破

      本项研究工作在物理和化学方法基础上，第一次从数学计算的角度，提出真正可用的突破光学衍射极限的通用算法理念。利用“荧光图像的分辨率提高等价于图像的相对稀疏性增加”（Sparsity）这个荧光超分辨率显微成像的通用先验知识，结合之前提出的信号时空连续性（Continuity）先验知识【2】，发明了两步迭代解卷积求解算法，即稀疏解卷积（Sparse deconvolution）方法。

      其中稀疏性约束恢复高频信息（朝向真实信号），同时这一重建过程也受到时空连续性的约束。这两个处于不同级别上的先验约束协同恢复信号，使得所提出的稀疏解卷积远远比只有单一约束的解卷积模型更加稳健和有效（图1）。首次能够有效鲁棒地突破现有光学显微系统的硬件限制，实现荧光的计算超分辨率显微成像，达到2倍左右分辨率提升。结合自主研发的超分辨率结构光（SIM）系统，实现目前活细胞光学成像中最高空间分辨率（60nm）下，速度最快（564Hz）、成像时间最长（1小时以上）的超分辨成像。

      并且，稀疏解卷积技术被证明可以广泛应用于各种荧光显微模态，其中包括了超分辨转盘共焦结构光显微镜（SD-SIM）【3】。经稀疏解卷积技术优化后的SD-SIM可以很容易地适应多色超分辨成像，其分辨率可优于90 nm。研究者们使用双色稀疏SD-SIM在活细胞中观测到了内质网与溶酶体接触的搭便车互作事件（Hitchhiking，管状内质网的末端粘附在沿着微管运动的溶酶体上）（图2）。

      稀疏SD-SIM还可以进行四色超分辨成像，允许在活细胞中同时观测溶酶体、线粒体、微管和细胞核的动态图像（图3）。

      同时，稀疏SD-SIM同样能够以优于90 nm的分辨率进行三维多色超分辨成像。使用稀疏SD-SIM，研究者们解析了活细胞三维线粒体外膜网络（Tom20-mCherry标记），样本厚度约7 μm（图4）。

      同样的，研究者们还在活体COS-7细胞的轴线上观察到细胞核、线粒体和微管的三维图像，并进行了三色成像（图5a）。经过稀疏解卷积优化后，微管成像分辨率的轴向FWHM从465 nm降低到228 nm（图5b）。可以看出，在一些轴向面被微管丝和线粒体侵入的区域，连续的、凸状的核结构向内弯曲变成凹状（图5c）。这种相互作用的变化表明微管蛋白网络可能影响细胞核的组装和形态。通过实际的生物样本实验量化，稀疏解卷积技术被证明能够实现近两倍稳定的空间分辨率提升，而并不需要付出额外的硬件代价。

观点评述

      此外，利用稀疏解卷积技术，研究者们还结合其自主研发的超分结构光（SIM）系统，实现了对活细胞中核孔、胰岛素囊泡等结构的低光毒性超快超分辨率成像。另外，稀疏解卷积技术在膨胀显微镜（ExM）【4】、受激辐射损耗显微镜（STED）【5】甚至微型化双光子显微镜（FHIRM-TPM 2.0）【6】上都取得了良好的分辨率提升效果。

      总之，通过稀疏解卷积算法（Sparse deconvolution）来实现计算荧光超分辨率成像，与目前基于特定物理原理或者特殊荧光探针的超分辨率方法都不相同，其可以与现有的多数商业荧光显微镜结合，有效提升它们的空间分辨率，看到更清楚的精细结构动态。

• PhotoniX是中国光学工程学会新办会刊，由中国光学工程学会、上海理工大学和西湖大学共同主办，由Springer Nature集团出版。上海理工大学顾敏院士和西湖大学仇旻教授担任期刊主编，庄松林院士担任期刊名誉主编，拥有强大的国际编委和编辑团队。属同行评议、开放获取（OA）高影响力国际期刊。PhotoniX主要报道国内外光学与光子学技术与信息、能源、材料、生命、精密制造、纳米、光电子器件、微纳米电子等学科交叉融合发展带来的颠覆性科研成果和最新的工程应用进展。以展现具有前沿性、多学科交叉和衍生性特点的技术为核心，成为推动国际前沿“使能技术”的平台。

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