前沿 | 多焦点大深度超分辨成像——助力在体神经元可视化

研究背景

      大脑是生物体内结构和功能最复杂的器官，包含着多达上千亿神经元和它们之间十万亿突触联系，从而产生了人类理解自然的强大能力，也构成了人类认识本身的最重要领域。然而，由于大脑神经网络的跨尺度复杂性以及现有成像技术的局限性，人类对大脑的探索依然处于粗浅水平。例如，活体大脑内神经元轴突和树突棘等精细结构的动态监测是研究神经信息处理及其可塑性的基础，但现有光学成像技术的空间分辨率和成像深度有限，仍然无法在足够的空间范围和分辨率水平上实现活体神经细胞精细结构的持续成像。因此，创新发展活体超分辨显微成像技术，实现大深度活体脑组织的精细结构及其动态过程成像是脑科学和神经系统疾病研究的重大需求。

      双光子激发荧光显微成像技术在神经科学领域发挥着重要作用。由于非线性吸收和发射的过程只发生在焦点附近很小的区域内，双光子成像具有天然的光学层析能力。此外，双光子激发显微成像使用的激发光相较于传统单光子激发光波长更长，可以穿透到更深的脑区。神经学家们利用该技术揭示了树突棘的形貌及其在运动学习等过程中的动态变化。在此基础上，为了进一步提升成像速度和分辨率，观察树突棘、突触前终末等的精细结构及其快速动态变化，研究者们提出了图像扫描显微成像技术，并通过成像过程的并行化进一步提高成像速度，发展了双光子多焦点结构光照明显微成像技术（Two-photon multifocal structured illumination microscopy, 2P-MSIM）。然而由于生物组织对光的散射以及样品内部折射率不均匀造成的像差，超分辨显微成像在活体深层组织研究方面仍然面临难以克服的技术难题。

论文导读

      光学成像技术已成为生物医学研究及临床诊断的重要工具。随着生命科学的发展，对光学成像的深度以及时间和空间分辨率都提出了越来越高的要求。为了解决超分辨荧光显微镜在对厚样品成像时离焦背景噪声大、成像深度小、成像速度慢等瓶颈问题，本文发展了一种基于自适应光学的双光子多焦点结构光照明显微成像（Two-photon multifocal structured illumination microscopy based on adaptive optics, AO 2P-MSIM）技术和系统。该技术利用双光子成像深度大的优势，使用自适应光学技术校正深层组织成像时由于样品内部折射率不均匀造成的像差，结合图像扫描显微技术提高成像分辨率，最终实现对活体细胞及组织的在体、实时动态显微成像，为脑科学、胚胎发育学、肿瘤学等研究提供技术支撑。该研究以“Deep tissue super-resolution imaging with adaptive optical two-photon multifocal structured illumination microscopy”为题目于2023年12月21日发表于PhotoniX 期刊。

主要研究内容

      本文将双光子激发与多焦点结构光照明显微成像技术结合，拓展了超分辨显微成像技术的穿透深度极限。为了克服深层组织中光学散射和像差对大深度超分辨显微成像的限制，将自适应光学技术引入到双光子多焦点结构光照明显微成像中，实现了活体神经元的超分辨动态成像。该技术使用液晶空间光调制器代替了传统微透镜阵列和扫描振镜组合，通过对激光的相位调制生成任意分布的多焦点激发光阵列，并通过叠加线性光栅相位实现点阵的高速移动；采用激光光路与荧光光路独立校正的策略，通过液晶空间光调制器加载波前校正相位，实现激光光路的像差校正；使用变形镜实现荧光光路的像差校正。通过对小鼠脑切片以及活体斑马鱼神经元的超分辨显微成像，展示了这种基于自适应光学的双光子多焦点结构光照明显微成像技术在神经科学领域中的巨大应用潜力。

技术突破

      双光子激发显微技术因其固有的光学层析能力，对活体样品光损伤小，并且在厚组织中具有良好的穿透性，为在体成像提供了强大的工具。通过与多焦点结构光照明显微成像技术结合，在厚组织超分辨显微成像方面具有良好的应用前景。传统的双光子多焦点结构光照明显微成像技术通常使用微透镜阵列生成双光子多焦点激发光阵列，虽然该策略可以获得较高的激光能量利用率，但微透镜阵列一旦构建到系统中，焦点数量和焦点之间的距离是固定的。此外，由于多重光学散射和像差引起的成像深度和空间分辨率退化，深层组织的超分辨显微成像面临许多挑战。

      自适应光学技术是恢复深层组织成像空间分辨率和信噪比的有效方法，通常是在激发光路中放置变形镜或空间光调制器，校正像差导致的聚焦光斑弥散，以恢复焦点体积和峰值强度。变形镜的反射面是由多个驱动器控制的连续薄膜，可以避免衍射效应造成的能量损失，主要校正低阶像差。液晶空间光调制器是在激发光路中广泛使用的像差校正元件，采用了紧密排列的液晶晶体阵列，空间分辨率高，可校正高阶像差。但液晶空间光调制器的使用要求入射光为偏振光，并对波长敏感。实际上，对于深层组织的超分辨显微成像，激光光路和荧光发射光路的像差校正都是必不可少的。

      本文发展的基于自适应光学的双光子多焦点结构光照明显微成像系统如图1所示。使用单个高速液晶空间光调制器代替传统的微透镜阵列和扫描振镜组合，实现多焦点激发光阵列的生成及扫描移动。同时，该液晶空间光调制器还用于校正激光光路的像差。为了进一步提高深层组织超分辨显微成像的像差校正性能，在荧光光路中放置了变形镜，以恢复受像差影响的成像分辨率。

      相比传统像差校正技术，本文分别使用液晶空间光调制器和变形镜，独立校正激光光路和荧光发射光路的像差。与仅使用液晶空间光调制器校正激光光路的像差相比，本文所提出的方法可以提高像差校正的性能。更重要的是，由于光学像差导致信噪比和分辨率严重退化，在荧光发射光路使用变形镜进行像差校正是实现深层组织超分辨显微成像的关键。本文采用液晶空间光调制器在激光光路进行像差校正是考虑了如下因素：1）液晶空间光调制器具有比变形镜更高的校正精度，可以产生更完美的多焦点激发光阵列；2）仅使用单个液晶空间光调制器进行多焦点扫描成像和像差校正，使整个大深度超分辨显微成像系统更加紧凑灵活；3）由于液晶空间光调制器帧速高，在实现多焦点激发光阵列高速扫描时，可以避免振镜的机械惯性在扫描中引起的伪影。

      神经元通过彼此之间的突触接触交流信息，构成动物个体信息处理的神经网络，因此观察突触精细结构及其动态变化是了解神经信息处理核心机制的关键所在。为了可视化这种精细结构并追踪其动态过程，本文对斑马鱼的运动神经元进行了约120分钟的连续动态成像（图2）。图2（A）对比了像差校正前后，210-230微米深处运动神经元的成像结果，对应的频域分布图像如图2（B）所示，空间频率分量的恢复表明，通过像差校正和超分辨图像重构提高了空间分辨率。轴突上模糊的形态突起变化在像差校正和超分辨图像处理之后变得更清晰（图2C）。值得注意的是，突起和轴突之间的连接结构在宽场图像中是观察不到的，但在经过像差校正的超分辨图像中非常明显。在对神经元时间序列成像中可以观察到，0 分钟时，突起（白色箭头）与轴突由两根纤细丝状体相连；60分钟左右，突起的形态发生了明显变化，并在120分钟形成新的突起。实验结果证明，基于自适应光学校正的双光子多焦点结构光照明显微成像技术在活体大深度超分辨显微成像中有很大潜力，可以实现神经元纤细丝状体精细结构的动态可视化。

观点评述

      本文实现活体大深度超分辨显微成像主要基于如下技术：1）具有超分辨显微成像能力的多焦点结构光照明显微成像技术；2）具有深层组织穿透能力和良好光学层析能力的双光子激发技术；3）具有像差校正能力的自适应光学技术。尽管多焦点结构光照明显微成像技术由于其基本原理的限制，无法实现类似于受激发射耗尽显微（Stimulated emission depletion microscopy, STED）、随机光学重建显微（Stochastic optical reconstruction microscopy, STORM）或光激活定位显微（Photo-activated localization microscopy, PALM）的超高空间分辨率，但它更适于在更大成像深度实现超分辨显微成像。针对活体深层组织成像存在的波前畸变问题，在成像系统中引入自适应光学波前校正技术，通过对系统和样品引起的像差同时进行校正，提高成像深度和成像分辨率。

      在本文发展的大深度多焦点超分辨显微成像系统中，液晶空间光调制器被外部触发，以与面阵探测器（相机）图像采集同步的速率加载相位图案。在扫描过程中，多焦点激发光阵列逐个像素地扫描整个视场，并将荧光信号记录在一系列原始图像中。在外部触发模式下，相机的帧速率受到探测面积的限制，通常比较慢。未来，可以引入更快、更灵敏的图像探测器和更高速率的液晶空间光调制器，以进一步改进大深度多焦点超分辨显微成像技术的成像速度。

主要作者

      张晨爽，深圳大学物理与光电工程学院博士后。主要从事超分辨显微成像和非线性光学成像研究。相关研究成果发表在Advanced Science，Nano Letters，Optics Letters，Optics Express等期刊，获授权中国发明专利2项。

      于斌，深圳大学物理与光电工程学院教授，博士生导师，深圳市高层次人才。主要从事超分辨显微技术及应用、计算光学成像、定量相位显微成像等研究。在包括Advanced Science，Nano Letters，Nanophotonics, Optics Letters等期刊发表SCI论文100余篇，获授权中国发明专利20余项，获深圳市科学技术奖自然科学二等奖两项。

      林丹樱，深圳大学副教授。从事超分辨显微成像、荧光寿命显微成像等研究，主持国家重点研发计划课题、国家自然科学基金面上项目等科研项目6项，在包括Chemical Society Reviews、Nanophotonics、Optics Letters等期刊发表SCI论文60余篇，获授权发明专利14项，研究成果获广东省自然科学二等奖、深圳市自然科学二等奖等科研奖励。

      屈军乐，深圳大学特聘教授，国家自然科学基金杰出青年基金获得者，国际光学工程学会、美国光学学会和中国光学学会会士。从事多模态非线性光学成像、超分辨显微成像、纳米生物光子技术及光治疗等研究，主持科技部重点研发计划、973课题，国家自然科学基金重大仪器、重点、重点国际合作、仪器专项等。在包括Nature Photonics, Nature Communications，PhotoniX等期刊发表SCI论文500余篇；获授权发明专利60余项，实现转让和授权使用18项；研究成果入选2014中国光学重要成果，获中国光学学会光学科技奖基础研究类二等奖，广东省科学技术奖自然科学二等奖等。

• PhotoniX 属同行评议、开放获取（OA）高影响力国际期刊。是中国光学工程学会会刊，由中国光学工程学会、清华大学、上海理工大学和西湖大学共同主办，由Springer Nature集团出版。上海理工大学顾敏院士和西湖大学仇旻教授担任期刊主编，庄松林院士担任期刊名誉主编。期刊拥有强大的国际编委和编辑团队。PhotoniX 主要报道国内外光学与光子学技术与信息、能源、材料、生命、精密制造、纳米、光电子器件、微纳米电子等学科交叉融合发展带来的颠覆性科研成果和最新的工程应用进展。以展现具有前沿性、多学科交叉和衍生性特点的技术为核心，成为推动国际前沿“使能技术”的平台。

• PhotoniX 已被SCI、EI、SCOPUS、DOAJ、ProQuest、CNKI、INSPEC、Dimensions等10多个数据库收录。2022年6月获得首个影响因子19.818，位列Q1区。同时进入《2022年中国科学院文献情报中心期刊分区表》，位列物理与天体物理大类和光学小类双一区，为Top期刊。中国科协首次颁布“光学工程和光学领域高质量期刊目录”PhotoniX 位列T1级。
  

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